外周血 th17、treg 细胞水平在溃疡性结肠炎和克罗恩病中的比较研究-k8凯发

外周血 th17、treg 细胞水平在溃疡性结肠炎和克罗恩病中的比较研究

文章发表于：《胃肠病学和肝病学杂志》

作者：尚瑞、吴军、卢光新、杨艳果（湖北医药学院附属人民医院）；郑雪皎（湖北十堰药学部）

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【摘要】  

目的：观察溃疡性结肠炎( uc) 和克罗恩病( cd) 外周血单个核细胞 ( pbmcs) 中 th17、treg 细胞水平和 il-17 mrna 表达水平的差异。 探讨 th17 和treg 在uc 和cd 发病机制中的作用。

方法：选取2014 年1 月 - 2015 年12 月在湖北医药学院附属人民医院住院治疗的 ibd 患者 100 例，其中 uc 患者 50 例，cd 患者 50 例，应用流式细胞仪技术检测两组患者外周血中 th17 与 treg细胞比例。 应用实时荧光定量pcr 技术检测两组患者il-17 和foxp3 mrna 水平的变化。

结果：cd 患者组外周血 th17 细胞比例为(2. 01 ± 0. 59)% ，uc 患者外周血 th17 细胞比例(4. 55 ± 0. 75)% ，两组比较差异有统计学意义( p < 0. 05)；cd 患者组外周血reg 细胞比例为(6. 08 ± 2. 10)% ，uc 患者为(3. 27 ± 0. 97)% ，两组比较差异有统计学意义( p < 0. 05)。 uc 患者组 il-17 mrna 水平约是 cd 患者的 4. 5 倍；uc 患者组 foxp3 mrna 水平约是 cd 患者的 0. 4 倍，差异均具有统计学意义( p < 0. 05)。

结论：th17 与treg 细胞比例在 uc 和 cd 中有显著性差异，可为临床 uc 和 cd 提供新的诊断方法，从而提高 uc 和 cd 诊断的正确率。

【关键词】炎症性肠病；溃疡性结肠炎；克罗恩病；th17 细胞；treg 细胞；il-17；

炎症性肠病( inflammatory bowel disease， ibd)，是一种常见的慢性特发性肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病( crohn’ s disease，cd) 和溃疡性结肠炎( ulcera- tive colitis， uc)。 近些年来 ibd 的发病率呈出急速增长的趋势[1-2] 。 其确切发病机制虽然至今未知， 但是有研究数据表明，其发病的部分原因是由于易感体质肠道菌群放松了对宿主的免疫反应[3-4] 。 免疫反应在其发病机制中发挥着最主要的作用，而 cd4 cd25 foxp3 调节性 t 细胞( treg ) 和辅助性 t 细胞 17 ( th17) 是参与免疫反应的两种关键性细胞。 treg 和th17 是异于 th1 和 th2 的 cd4 t 淋巴细胞。 treg 细胞是 cd4 t 细胞的一类特殊分支，主要作用是维持免疫系统的稳定性以及耐受性，并且在防止免疫炎症反应的增加和保护免疫机体上也发挥重要作用。近几年，在许多动物和人的研究中得知，丢失 treg 细胞将会造成严重的自身免疫性炎症的发生；相反，增加treg 细胞也不利于机体健康，在许多癌症中，增加的treg 细胞通过与自身免疫监控系统相互作用，抑制抗肿瘤免疫活性细胞的活性， 促进肿瘤发生、 发展。foxp3 是 treg 细胞的特异性标记物， 作为转录因子forkhead 家族的一员，具有调控 treg 细胞生长发育的作用。 而特异性产生 il-17 的 th17 细胞则被认为是存在于天然性免疫系统与获得性免疫系统之间的桥梁，是炎症反应的使动和调节因素[5-8] 。 th17 细胞在固有免疫、适应性免疫和自身免疫方面均发挥至关重要的作用。 th17 细胞在炎症反应的过程中主要发挥促进炎症反应的功效。

treg 细胞和 th17 细胞之间存在复杂的相互作用关系，在分化上二者相互协同，在功能上又相互竞争， 其平衡在炎症反应中起关键性作用。 目前，th17 / treg 两种细胞的平衡紊乱已成为新的研究热点，但是在cd 和 uc 中研究很少。 所以本文主要就两种细胞在 uc 和 cd 中存在的比例差异进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 

选取 2014 年 1 月 - 2015 年 12 月在湖北医药学院附属人民医院住院治疗的 ibd 患者，uc患者(活动期)50 例，男女比例为 28∶ 22，年龄(45. 45 ± 8. 34) 岁，cd 患者( 活动期)50 例，男女比例为 26∶ 24，年龄(48. 35 ± 7. 56) 岁。 诊断标准按照中华医学会消化道学分会制定的关于 ibd 诊断标准[9] 。 两组性别、年龄比较差异无统计学意义( p > 0. 05)，具有可比性。两组患者均采集肘静脉肝素抗凝血 2. 0 ml 和 edta抗凝血 2. 0 ml。

1.2  纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准：(1) uc 的纳入标准：连续性结膜、无肉芽肿、结直肠受累；(2) cd 的纳入标准：从口腔至肛门慢性肉芽肿损害；呈跳跃性，延长轴或肠周或分散的溃疡的非连续性病变；活检黏膜可见黏蛋白滞留。

1.2.2 排除标准：(1) 以各种有效的诊断方法，如细菌学、放射学、组织学排除感染性结肠炎、缺血性结肠炎、放射性结肠炎等；( 2 ) 怀疑有结肠癌变的患者；(3) 心、肾功能显著下降的患者；(4) 存在其他免疫学疾病的患者。 所有入选患者均经过医院伦理委员会批准，并且需取得每位患者的同意并签署相应的书面同意书。

1.3  试剂和仪器

1.3.1 试剂：布雷非得菌素 a( bfa)、4% 多聚甲醛( pfa)、细胞因子刺激剂( pma)。 fitc-il-17 流式抗体， apc-cd4 流式抗体， fitc-cd25 流式抗体， pe-foxp3 流式抗体均购自美国 bd 公司。 逆转录试剂盒和实时荧光定量 pcr 试剂盒购自中国全式金生物技术有限公司。

1.3.2 仪器：流式细胞仪( 美国 bd 公司)；实时 pcr仪( life technologies)。

1.4 流式细胞术 

用流式细胞术检测两组患者外周血 pbmcs 中细胞亚群 th17 和 treg 的比例。 用 il-17抗体染色结果显示为阳性的细胞群称作th17 细胞，将cd4 cd25 foxp3 三种抗体染色均显示为阳性的细胞群称作 treg 细胞。

1.4.1 th17 细胞的检测：用含有 100 g / l 胎牛血清( fbs) 的 1640 培养基，将 pbmcs 的浓度调节为 (1 ~5) × 105 个/ ml； 一支试管加入淋巴细胞刺激剂混合液 3 μl( 对照组不加淋巴细胞刺激剂混合液)；将试管放置于 37 ℃ ，且体积分数 5% co2 细胞培养箱中，孵育5 h；孵育完成后以 800 r / min 离心 5 min，去上清液；用 2 ml pbs 清洗两次，800 r / min 离心 5 min；加入固定剂 100 μl，于漩涡震荡器上震荡 2 ~ 5 s 混匀，然后避光， 室温孵育 15 min，后加入 3 ml pbs 洗液，800 r / min 离心 5 min，弃上清；加入100 μl 破膜剂，避光孵育5 min，后不需清洗直接加入fitc-il-17 流式抗体 10 μl，震荡混匀，室温避光孵育 30 min； th17 细胞同型对照管则需要加 10 μl fitc-ig g 单克隆荧光抗体；500 μl pbs 液重悬细胞，待测。

1.4.2 treg 细胞的检测：取流式细胞仪上样管；每管加入 apc-cd4、fitc-cd25、pe-foxp3 各 10 μl；每管加 apc-lg g1，fitc-ig g1、pe-ig g1 各 10 μl( 作为对照管)，其中这三种流式抗体分别做一个单个抗体对照，以便于流式上机检测时补偿的调节； 加入 100 μl 抗凝全血，于漩涡震荡仪上振荡 2 ~ 5 s 混匀，避光室温作用 30 min 后加入 500 μl 溶血剂，振荡混匀，放置 37 ℃ 水浴箱中孵育 15 min； 待管内液体透明后， 以 800 r / min 离心 5 min，然后将上清倒掉后加入 500 μl pbs 重悬细胞，待测。

1.5 实时定量

pcr( rt-pcr)   rt-pcr 检测技术用于检测 pbmcs 中细胞对应的转录因子。 th17 细胞检测 il-17，而 treg 细胞检测 foxp3。

1.6 统计学方法  

釆用 spss 17. 0 软件进行资料分析。 在开始检验前先对要处理的数据进行方差齐性以及正态性检验。 计量资料以 x ± s 表示，两组之间的比较选用 t 检验。 p < 0. 05 为差异统计学意义。

2 结果

2.1 外周血 pbmcs 中 th17 和 treg 细胞比例

cd组患者外周血 th17 细胞比例为(2. 01 ± 0. 59)% ，uc组患者外周血 th17 细胞比例为(4. 55 ± 0. 75)% ，uc 组患者 th17 细胞比例明显高于 cd 组，差异有统计学意义( p < 0. 05)。

treg 细胞：cd 组外周血 treg 细胞比例为(6. 08 ± 2. 10)% ，uc 组为(3. 27 ± 0. 97)% ， cd 组 treg 细胞比例明显高于 uc 组，差异有统计学意义( p < 0. 05)。

2.2 两组患者 pbmcs 中 il-17 和 foxp3 mrna 水平变化

uc 组 il-17 mrna 水平约是 cd 患者的 4. 5 倍，而 uc 组 foxp3 mrna 水平约是 cd 组的 0. 4 倍，差异有统计学意义( p < 0. 05)。

3 讨论

ibd 是典型的消化系统疾病，临床表现是腹泻、黏液脓血便、腹痛、里急后重等。 90% 以上患者都有腹泻，轻者每日排便 3 ~ 4 次或腹泻与便秘交替，重者每日可达 10 ~ 30 次。 且反复发作，属慢性疾病。

ibd 是一种诱因以及致病因素迄今尚且未完全阐明的肠道炎症性疾病。 近年来，越来越多的研究认为， 免疫调节紊乱、基因遗传是致病和发病机制的因素之一，但是免疫异常诱因在各种研究中占有重要地位。th17 细胞参与了系统免疫紊乱发生过程，th17 细胞和 treg 细胞数量和( 或) 功能的相互作用( 变化及转化) 可能是 ibd 的致病、发病的罪魁祸首[10-11] 。 th17与 treg 细胞的失衡这一新的发现，给我们带来了治疗ibd 的新靶点，我们可以通过各种干预手段把 th17 / treg 细胞进行权重配比以达到最初无炎症时的平衡状态，从而达到预防与治疗的作用。 其实，这已成为了研究的热点，也是未来发展新方向。

不过，由于体内环境错综复杂，所以在这个层面上还有很多亟待解决的问题，如在体内消减 treg 细胞的安全方法、在体内的相互影响机制及操作稳定性等。因此，我们仍需对 th17 / treg 细胞进行更深入的研究， 从而为 ibd 预防和治疗提供新的思路。

【参考文献】

[1]薛林云，欧阳钦，黄中华等. 近 20 年中国 ibd 研究进展--20 年文献总结[ j]. 国际消化病杂志，2013，33(4)：276-278.

[2]apdw2004 chinese ibd working group. retrospective analysis of 515 cases of crohn's disease hospitalization in china： nationwide study from 1990  to 2003  [ j ]. j gastroenterol  hepatol，2006，21 ( 6 )：1009-1015. 

[3]ek we， d’ amato m， halfvarson j. the history of genetics in inflam- matory bowel disease [ j ].  ann gastroenterol， 2014，27 ( 4 )： 294-303.

[4]lees cw， satsangi j. genetics of inflammatory bowel disease： implica- tions for disease pathogenesis and natural history [ j]. expert rev gas- troenterol hepatol， 2009，3(5)：513-534.

[5]abdulahad wh， stegeman ca， limburg pc， et al. skewed distribu- tion of th17 lymphocytes in patients with wegener's granulomatosis in remission [ j]. arthritis rheum， 2008，58(7)：2196-2205.

[6]komiyama y， nakae s， matsuki t， et al. il-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis [ j]. j immunol， 2006，177(1)：566-573.

[7]刘雪平，王轶，赵治彬等. 炎症性肠病患者外周血 th17 细胞的变化及其临床意义[ j]. 胃肠病学，2010，15(5)：284-287.

[8]fujino s， andoh a， bamba s， et al. increased expression of interleu- kin 17 in inflammatory bowel disease [ j ]. gut，2003，52 ( 1 )：65-70.

[9]中华医学会消化道学分会炎症性肠病协作组. 对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[ j]. 胃肠病学，2007，12(8)：488-495.

[10]abegunde at， muhammad bh， bhatti o， et al. environmental risk factors for inflammatory bowel diseases：evidence based literature re- view [ j]. world j gastroenterol， 2016，22(27)：6296-6317.

[11]bernardazzi c， pêgo b， de souza hs. neuroimmunomodulation in the gut： focus on inflammatory bowel disease [ j]. mediators inflamm， 2016，2016：1363818.