克服car-k8凯发

曾几何时，我们听到癌症，就等同于被判了死刑。随着医疗的发展和科学技术的进步，各种肿瘤治疗手段，从传统的外科手术，到放化疗等更精准的治疗方案，再到更多抗肿瘤新药的诞生：传统的小分子化药，单抗药物，抗体偶联药物，免疫细胞治疗等等，越来越多的新疗法层出不穷。在我们有生之年，大有希望看到癌症从不治之症变成慢性病。

       目前，肿瘤免疫治疗被公认为经典的手术、放疗、化疗三大疗法之外的“第四种疗法”。这种方法以提高机体的免疫能力为目的，控制肿瘤发展。免疫细胞疗法的思路大致又分为两种：一种是把肿瘤的特征“告诉”免疫细胞，让它们去搜寻、杀伤。这种方法的代表是car-t等免疫细胞治疗；另一种能让免疫细胞不被麻痹，继续攻击肿瘤细胞。这种思路的代表是pd-1/pd-l1抗体药物。这种药物能阻断肿瘤细胞对t细胞的“欺骗”，让t细胞恢复对肿瘤细胞的杀伤力。

       2012年5月，艾米莉在生命垂危之际，成为第一位接受car-t细胞免疫疗法的儿童患者，迄今都再未复发。此后，这一治疗方法就获得了大家的广泛关注。但9年过去了，这一技术在临床上仍未广泛使用。主要原因之一就是由于car-t费用高昂，目前在美国打一针需花费30-40万美元，2021年复星凯特和药明巨诺引进的海外car-t细胞治疗产品陆续获批上市，其120万人民币一针的高价也让整个社会为之震惊。

▲ 已上市/即将上市的car-t药物及其定价和销售情况（2020年）

       目前，对肿瘤患者而言，有两座大山横亘前方：一个是药物的有效性，肿瘤通常很难根治，容易复发。另一个则是高额的治疗费用，患上肿瘤往往意味着“倾家荡产”。一部《我不是药神》把肿瘤患者看病贵的问题推到了风口浪尖，但电影毕竟是电影，生活里的苦难可能比电影更刺痛人心。癌症，几乎直接对应“天价药”。

       相比于上文提到的上百万一针的car-t免疫细胞治疗药物，另一种免疫细胞疗法的pd-1/pd-l1抗体药物，市场推广情况则好得多。虽然pd-1/pd-l1抗体药物的有效率在很多病症上并不是很高，有些甚至不到20%，且在使用后一旦出现耐药性，后续治疗将变的更加棘手。但其价格相对低廉，从刚上市的十几万元一年到目前的几万元一年，并在2021年进入了国内医保，也因此被奉为抗癌“神药”。

       未来，我们有可能有一款类似pd-1/pd-l1抗体药物，甚至是类似化药的免疫细胞治疗药物吗？不仅价格在大众可承受范围内，而且不用高度个体定制化，可以跟常规药物一样即取即用？我们相信，这个问题的答案，也就是癌症治疗的新曙光。到那一天，这些“天价神药”才能真真正正进入寻常百姓家。

       解决这一问题，现在科学界主要有两个方法：一是在体外大规模制备通用免疫细胞，对其进行基因工程改造让其带上car精准杀伤肿瘤细胞，这一方法最有代表性的是car-nk；第二种方法则是在体内直接修饰免疫细胞将其转化为带car的免疫细胞如car-t等，而无需体外提取制备，也就是in vivo car。

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in vitro car （体外免疫细胞治疗方法）中的明星：car-nk

1、自体细胞为何会逐渐退出舞台？

       目前获批的car-t细胞疗法都是自体产品，其制备过程大致是：首先采集患者自身的外周血，分离免疫细胞，然后对其进行制备和回输。目前的技术工艺只能实现单人单次制备、无法规模化，造成免疫细胞价格较高、运输半径受限、固定资产投入大等问题。值得注意的是，每次制备的细胞数量和质量参差不齐，难以保证一致性。另外，如果患者自身的细胞数量和质量达不到要求，将无法使用自体细胞疗法。 通用型/异体细胞疗法是从健康捐献者体内提取分离细胞/利用ipsc细胞衍生而来的细胞，其余改造步骤基本相同。通用型细胞可一次性开发多个治疗批次，储存起来以治疗大批患者，大大节省了成本。 相对于自体细胞疗法，通用细胞可实现商业化大规模批量生产，质量可控，成本低廉。当有患者需要免疫细胞的时候，可随取随用，大大降低了时间成本和等待中有可能出现的风险。对于自身体内免疫细胞有问题的患者，通用细胞疗法无疑是最理想的选择。

2、通用car-t细胞开发的主要难点？

       器官移植时，很容易发生“排异反应”，这一反应也被称为免疫排斥，或移植物抗宿主病（gvdh）。产生这一反应的主要原因是由于t细胞的tcr上带有一组高度多态的基因编码构成的mhc分子，也被称为人类白细胞抗原（hla）。 自体t细胞带有相同的hla，输入后不会被机体排斥，而异体来源的t细胞想要制成通用型car-t，我们就需要 通过基因编辑的方法破坏t细胞的tcr基因和hla-i类基因。 但这一方案有不少的安全风险：首先，hla阴性通用型细胞可能完全逃避免疫系统监视；其次，hla表达的缺失或减少有助于肿瘤细胞逃避免疫应答。因此，如果移植的hla-阴性细胞发生恶性转化，则很难通过正常的免疫机制消除。理论上，甚至有可能将完全逃避异基因识别的肿瘤细胞转移到其他个体身上。因而需要工程引入自杀基因，如果这些细胞发生恶性转化，就可以将其清除掉。 但自杀基因也有其安全性问题：自杀系统的安全性取决于多种因素，包括特定的自杀基因、如何整合到基因组中以及治疗需要多少细胞。大多数情况下，自杀基因，如icasp9或编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的基因，都是随机整合的。这可能会导致因沉默或表观遗传改变，也有可能因突变而丧失功能。 因此，目前虽然有不少试图采用基因编辑方法制备通用型car-t细胞的公司，但整体技术路线难度较高，成本可降低的空间有限，且未来临床上还存在较高的潜在风险。

▲ 采用不同基因编辑方法制备通用型car-t细胞的公司

3、car-nk将是通用型免疫细胞的最好选择。

       nk（nature kill）细胞，也即天然杀伤细胞，天然优点之一就是其表面缺乏tcr，没有mhc限制性，免疫原性低，因此安全性很高，无需基因编辑/处理即可异体使用。因此，我们可以通过使用健康人、脐带血或干细胞来源的nk细胞，来制备car-nk细胞质量产品，从而减少患者的等待时间和治疗费用。 除此以外，nk细胞治疗还有以下一系列优势： 

（1）更好的安全性：很少有细胞因子释放综合症、神经毒性和移植物抗宿主反应 (gvhd) 从安全性的角度来看，car-nk较car-t寿命较短，与目前car-t常须引入自杀机制相比，car-nk通常不会发生持续的靶向效应，安全性显著提升。此外，由于表面缺少tcr，通用型car-nk通常不会引起gvhd，不但提升了使用的便利性，且安全性大幅提升。同时，针对最值得关注的细胞因子释放综合征（crs），由于car-nk不产生或较少产生il-6，而主要产生ifn-γ和gm-csf等细胞因子，因此不易诱发严重的细胞因子风暴。 

（2）更多的灭瘤途径：执行细胞脱粒、激活凋亡途径和介导adcc功能 car-nk细胞，不仅可通过car特异性识别抗原表达肿瘤的能力，还可以通过nk细胞受体自身来消除肿瘤。与t细胞的杀伤作用机制不同，nk细胞的杀伤活性受细胞表面的抑制性受体和激活性受体的共同调控，当激活与抑制的平衡被打破，nk细胞便会行使相应的功能。这些信号激活衔接蛋白，释放穿孔素和颗粒酶，并控制细胞因子的产生。 nk细胞杀伤靶细胞的机制多样，有更多的灭瘤途径：其可以通过释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞质颗粒直接杀伤靶细胞。也可以释放细胞因子，如ifn-γ、tnf-α等，通过与肿瘤细胞表面相应受体的相互作用诱导肿瘤细胞凋亡。此外，nk细胞还可以介导adcc功能，其fc受体cd16与抗体的fc段结合，可激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（adcc）来杀伤细胞。 

（3）可治疗实体瘤：靶向多种抗原，克服肿瘤微环境导致的药物抵抗问题 从疗效的角度，car-nk有望突破car-t实体瘤治疗的瓶颈，car-t疗法目前在实体瘤的治疗中进展滞缓，其中一个重要的原因在于t细胞表面的pd-1过表达和肿瘤细胞表面的pd-l1过表达导致的免疫抑制现象。而pd-1等免疫检查点在nk细胞表面表达较低，受肿瘤微环境免疫抑制较小。 nk细胞可靶向多种抗原也使其在攻克实体瘤方面具有更多优势。生理情况下，nk细胞抑制性受体识别正常组织细胞表面广泛表达的mhc-ⅰ类分子而使nk细胞功能受到抑制，无法杀伤自身正常组织细胞。在肿瘤组织中，一方面肿瘤细胞表面mhc-ⅰ类分子表达通常发生下调，另一方面活化受体的配体如nkp30、nkp44、nkp46等表达上调，这两方面的因素将导致nk细胞活化最终杀伤肿瘤细胞。

       因此，从安全性、有效性和未来面对实体瘤的潜力等多种角度来看，我们认为car-nk是通用型细胞治疗最好的选择之一。

4、ipsc来源的nk细胞具有明显优势。

       目前研究中使用的nk细胞主要有三种来源：外周血分离、nk细胞系培养、干细胞分化。 外周血来源（自体或异体）：相比自体nk细胞，异体nk细胞会保持较为持久的杀伤效果。但外周血来源的异体nk细胞如何提纯清楚异体t细胞是个难题。 目前已有较为成熟有效的方法从外周血中纯化扩增足够量的nk细胞用于过继性免疫治疗。自体nk细胞和异体nk细胞都可以进行car修饰，但它们的细胞特性并不相同。自体car-nk细胞回输后，其抑制性受体与自体正常细胞表达的hla-i类分子结合而产生抑制信号，会抑制nk细胞的杀伤效应。虽然肿瘤细胞丢失了经典的hla-i类分子，但是非经典的hla-i类分子hla-g、hla-e等的表达，同样能够抑制nk细胞的活化。异体nk细胞由于表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer-cell immunoglobulin-like receptors，kirs）与患者hla-i类分子并不匹配，因此并不会产生抑制信号引起干扰，所以相比自体nk细胞，异体nk细胞会保持较为持久的杀伤效果。 但异体nk细胞供者血液中存在着以t细胞为主的其他淋巴细胞，因此在用于治疗之前，必须要彻底清除异体t细胞。否则这些杂细胞的存在会引起移植物抗宿主病（gvhd）。 

       nk细胞系：最为广泛使用的nk-92细胞系存在明显的缺点，如潜在的致瘤性和eb病毒易感性等。 nk细胞有许多成熟的细胞系，包括nk-92、nkg、yt、nk-ys、hank-1、yts和nkl等，nk细胞系体外扩增得到的细胞群体一致性更好，且nk细胞系并不涉及分选纯化步骤。 其中，nk-92细胞系是目前在car-nk中研究最为广泛的细胞系，于1992年从1例50岁的非霍奇金氏淋巴瘤男性患者体内分离得到，生长呈il-2依赖性。与原代nk细胞相比，nk-92细胞系最大的优势在于其表面的抑制性受体（如kir）表达很低，抑制性受体信号的缺失使得其对多种肿瘤的杀伤能力要优于原代nk细胞或者经细胞因子活化的其他杀伤细胞。此外，nk-92在实体瘤治疗中也有一定的潜力。car-t在实体瘤中效果不佳的重要原因是肿瘤细胞高表达pd-l1与t细胞表面的抑制分子pd-1结合进而抑制了其杀伤活性，而nk-92表面抑制性受体的缺失使之能够避免类似抑制信号的干扰。但是nk-92也存在着一些明显的缺点，例如潜在的致瘤性和eb病毒易感性等，因此，nk-92必须经过辐照后才能够使用。 

       ipsc分化的nk细胞：除了nk细胞系和外周血来源的nk细胞之外，诱导多能干细胞（ipsc）、脐带血和胚胎干细胞等多种干性细胞分化而来的nk细胞同样具有供car修饰的潜力。干性细胞分化而来的nk细胞的表型与外周血来源的nk细胞较为相近且其生长能力更强，且细胞纯度较高，是一种较好的nk来源。但成体干细胞来源困难、体外扩增较难且有分化局限性；胚胎干细胞的分化潜能最大，却一直受限于伦理问题以及个体化差异、免疫排异等问题，因此发展和转化应用也受到一定局限。与此相比，ipsc干细胞没有伦理问题，来源容易，利用成体细胞（如皮肤，血液）可获得，可个体化的制备，免疫排异小，具备强分化能力，能分化出不同的功能细胞；可无限扩增，可降低成本且细胞一致性高，具有明显的应用优势。 不同来源的nk细胞对比如下图所示：

5、ipsc来源的car-nk制备难度显著降低。

       目前car-t以及其他来源的nk细胞，通常涉及到2个关键步骤： （1）从自体血液中提取分离t/nk细胞； （2）带car分子的病毒制备以及用病毒感染传导car分子。 与car-t等制备来源不同，干细胞来源的car-nk，起始细胞用的干细胞可以无限增殖，不存在提取纯化的步骤。另外，car的转染可以直接用基因编辑进行，不需要复杂的病毒转染体系，操作更为简便，更适合规模化生产，并可显著降低生产成本。

▲ 不同来源的免疫细胞治疗药物制备途径及难易程度对比 目前，干细胞来源car-nk细胞疗法的核心技术难点在于建立高效的人多能干细胞定向nk造血分化体系。已有nk造血分化体系的低效率，导致了干细胞来源car-nk的高技术门槛，而这一技术最大瓶颈在于如何高效获得“永久造血前体细胞”。

6、行业标杆公司美国fate therapeutics何以股价暴涨？

       fate therapeutics, inc.(nasdaq:fate)创立于2007年，总部位于美国加州san diego，目前全职雇员279人。该公司有两大nk细胞管线，一个是从健康人外周血培养获取强杀伤力的nk细胞，另一个是从诱导多能干细胞（ipsc）分化出来具有高亲和力的nk细胞。而目前被批ind申请的ft500、ft519、ft596都是基于诱导多能干细胞（ipsc）的天然杀伤（nk）细胞。 fate公司于2013年上市，公司前期市值不高，2018年以前一直在1-2亿美金徘徊。直到2018年底，fda批准其首例产品ind后，股价一路上涨，并在2020年底于美国血液学年会（ash）发布初期临床数据后，2021年1月估值一度达到百亿市值。 此前，fate公司讲述通用细胞的故事已经有很长时间，但此前大家对ipsc分化而来的nk用于临床的效果一直半信半疑，降成本这事儿虽妙，但关键还是在于能否真正有效。因此，一旦大家发现car-nk的临床表现不弱于car-t，其股价不迅速增长就奇怪了。 2021年6月，fate进一步在2021年美国临床肿瘤学会（asco）年会上公布了其在研自然杀伤细胞（nk cell）疗法ft516，与rituximab联用，治疗复发/难治性b细胞淋巴瘤患者的积极1期临床试验数据。截至2021年3月11日，总计11例患者可用于安全性和疗效评估。试验结果显示，11例患者中的8例达到客观缓解，包括6例达到完全缓解（55%）。这些患者既往平均接受过3种前期治疗，特别值得注意的是，其中4例既往接受过自体cd19 car-t细胞治疗。在安全性方面，同样未发现剂量限制性毒性，未发现ft516相关严重不良事件和ft516相关3级以上不良事件。

       car-nk的初步临床效  果是完全可以媲美car-t的，而且fate公布的成本情况更加激动人心：fate每次可以生产300人份，每人份成本3000美元，其中纯物料成本大约为1200美元。fate宣称其car-nk产品上市后预计售价2-3万美元，仅为现在car-t产品售价（40-50万美元）的1/20。而这一技术如果拿到国内进行临床应用，据我们了解的情况，其成本还可能将有数十倍的降低空间。因此，car-nk未来很有可能成为另一款跟pd-1/pd-l1单抗 类似的肿瘤药物。

▲ fate 公布的car-nk生产制备成本情况 目前，全球正在进行的免疫细胞治疗临床试验共有520项，共使用了64种不同的car，其中96.4％的试验都使用car-t细胞，car-nk细胞领域仍处于起步阶段。 随着car-nk细胞疗法的临床价值凸显，不管是赛诺菲、百时美施贵宝等制药巨头还是catamaran bio、artiva bio等生物技术初创公司都相继布局car-nk赛道。显而易见，car-nk已成为继car-t之后最引人关注的工程细胞疗法。

▲ 2020年以来，car－nk领域国外部分合作、交易事件（根据公开资料不完全统计） 尽管car-nk细胞具有很好地临床潜力，但科学研究永远不会是一番风顺。car-nk免疫细胞治疗药物在开发上仍面临一系列的挑战，包括：（1）nk细胞对基因工程的抗性；（2）nk细胞的增殖潜力有限；（3）它们对输液的持久性有限等问题。 不过，近些年随着对nk的细胞生物学，免疫学，以及记忆性nk细胞的研究和认识越来越深入，对nk细胞的免疫相关受体的信号通路等新的研究越来越丰富，越来越多的研究为nk细胞在免疫治疗中的应用奠定了良好的基础。相信随着理论知识的更加完善，临床研究的进行，对当前car-nk细胞面临挑战终将攻克，car-nk细胞疗法将为肿瘤免疫治疗带来革命性进展，给肿瘤患者带来新的曙光。

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in vivo car （体内免疫细胞治疗方法）：颠覆细胞治疗的下一代技术

       体外免疫细胞治疗方法无论是自体还是异体细胞，都涉及到细胞的分离保存回输等步骤，因此将面临制备时间长、储存及运输不便、价格相对高昂等问题。而这一问题的终极办法应该是直接在患者体内进行t细胞改造及扩增，让其带car去攻击肿瘤细胞，从而不需要在体外制备细胞再回输至患者体内才能进行治疗。

       in vivo car将细胞治疗的工艺进一步简化，让细胞药物变得即时可用，有潜力成为颠覆现有细胞治疗的下一代技术。 in vivo car的研发有两个核心难点，一个在于如何将car特异性的传导到体内免疫细胞，也即是细胞传递工作能否高效进行。另一个则在于传导car后的免疫细胞如何保持可扩增性和持久性。 几乎每一种人类疾病都起源于细胞。然而，唯一容易进入细胞质的治疗药物是小分子。小分子从早期就成为现代制药工业的基础，但它们的相对简单意味着它们无法永久治愈或逆转大多数疾病。相反，蛋白质和核酸是提供戏剧性治疗结果的复杂分子，其在基因编辑、基因治疗、rna干扰和mrna等治疗领域的突破目前已经证明。但是，蛋白质和核酸疗法很难达到细胞内的目标。因此，我们希望有一种方法能结合蛋白质和核酸药物的治疗能力和小分子药物的递送范围。为了实现这一目标，我们需要在细胞内传递方面取得突破。

▲ 细  胞内物质传递示意图 目前，细胞内传递面临两个基本挑战：第一，在体内所有细胞类型中寻找特定的靶细胞类型；第二，有效克服在疏水细胞膜上沉积亲水有效载荷分子的热力学障碍。如今，细胞内传输技术与2010年的情况大相径庭。以目前最热门的mrna为例，大多数细胞内传递方法都是基于合成化学衍生的阳离子和可电离脂质纳米颗粒。这些纳米粒子瞬间将细胞的内小体打开，以便将它们的货物释放到细胞的细胞质中。但是，尽管在这一行业已进行了几十年的研究，但这一方法仍尚未实现高细胞特异性或有效的细胞质交付。这是因为脂质纳米颗粒几乎不分青红皂白地被数量有限的高内吞细胞(例如巨噬细胞)所吞噬，因此只能释放大约1%的核酸。 现在，研究这个赛道的公司主要有两家：首轮融资7亿美元，目前估值24亿美元的明星公司sana biotechnology，以及2021年6月刚完成b轮2.1亿美元融资的umoja bio。目前，这一新兴行业刚刚起步，这两家使用了不同的细胞传递技术，并且在如何保持细胞功能性和持久性方面各有其特色方案。

sana biotechnology （融合素技术）

       sana发现胞内转运是由一种独特的膜蛋白(称为融合素)来实现的。这些融合素存在于膜囊泡和包膜病毒表面，这些病毒与目标细胞结合并融合，将其有效载荷传递到细胞质中。融合素对生命至关重要：2013年诺贝尔奖的颁发，是因为它揭示了融合素在细胞内生物学中的关键作用，即小泡以编程方式相互融合，从而使整个生物分子序列能够特异、有效地进入细胞的另一个膜封闭区域。

▲ sana 融合素技术 因此，sana 通过融合素 / 脂质体联合体（fusosome）特异性地将 car 递送到患者体内细胞里面，即将患者身体作为生物反应器来制造 car-t 细胞疗法，从而解决当前 car-t 细胞复杂的制造流程。对于t细胞，靶向cd8的融合素显示出细胞特异性的选择性和高效的体外和体内基因转导，导致明显的剂量依赖性体内肿瘤根除。对肝细胞而言，肝细胞靶向融合素在工程细胞系和人肝细胞中都表现出对肝细胞表面蛋白的特异性和高效的转导。融合素靶向载体在体内高效和细胞特异性传递基因的潜力可以为未来多种疾病的基因治疗打开新途径。

umoja bio（慢病毒载体技术）

       umoja的核心产品uv-vv100是通过慢病毒转导在体内进行基因工程的自体t细胞，使用vivovec药物递送平台，共表达cd19特异性嵌合抗原受体(car)和一种新型雷帕霉素激活的细胞因子受体(racr)。 据umojak8凯发官网显示，该技术平台有三个核心组件：vivovec 平台、racr / car 控制系统和 tumortag 靶向技术。

▲ umoja 技术平台示意图 vivovec是一个体内递送平台，可以通过慢病毒转染患者体内的t细胞，经过人体淋巴系统生成表达嵌合抗原受体（car）的car-t细胞，即vivocar-t细胞，以增强患者免疫力。 racr/car是一种针对合成受体有效载荷架构的控制系统，可以有效控制 vivocar-t 细胞的扩增和活性。其可以通过在car-t细胞表面同时表达雷帕霉素激活细胞因子受体（racr），让成功转染的car-t细胞的增殖可以受到外来药物的控制，这样医生就通过使用 fda 批准的药物如雷帕霉素等免疫抑制剂来精准调节vivocar-t 细胞的活性。 而tumortag靶向技术可以对肿瘤细胞进行“标签化”。贴上 “标签” 后的肿瘤细胞可以与 vivocar-t 细胞进行结合，从而让 vivocar-t 细胞精准靶向并杀伤癌细胞，避免肿瘤免疫逃逸。

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总结

       目前，car-t细胞治疗是免疫肿瘤学中最活跃的研究领域。国内外都正在进行诸多临床试验和临床前研究，以扩大car-t细胞的治疗应用。但如前所述，car-t细胞的产生是一个涉及细胞治疗、基因治疗和免疫治疗的复合系统。这种复杂的car-t细胞生成程序阻碍了它的广泛应用。 科学家们正在制定不同策略试图来产生同种异体car-t细胞，包括t细胞的基因组编辑，依赖于纳米粒子的注入的t细胞体内工程，以及涉及慢病毒的策略，使用替代效应细胞(nk细胞、γδt细胞和巨噬细胞)，供体来源的同种异体car-t细胞和非同种反应性t细胞以及拆分、通用和可编程的car系统等等。所有这些方法都有其优点和缺点， nk细胞作为天然的同种异体细胞，我们相信其将很有希望解决现有通用car-t细胞开发难、制备贵的问题，使免疫细胞治疗更简单、更便宜。 而下一代的免疫细胞治疗技术，基于体内细胞工程技术的in vivo car，国内外也都已经开始进入研究发展的快阶段。我们相信这一新技术的出现将进一步克服上述障碍，大大简化临床环境中基于细胞的治疗的制造过程，使基因工程细胞治疗更便宜、更有效，把目前复杂的、个性化的免疫细胞治疗转变为广泛适用的产品。 我们欣喜地看到，不停涌现的这些新技术，在不远的未来很有希望让我们的免疫细胞疗法变得更为价格亲民，触手可及，普惠大众。我们也很期待，能有更多的新机制、新靶点被挖掘和发现，更够让免疫细胞治疗更好的用于实体瘤治疗，给癌症治疗带来新的曙光！